2022年8月2日，The Plant Journal杂志在线发表了德国亚琛大学和马普所Acevedo-Garcia等人题为“Barley Ror1encodes a class XI myosin required formlo-based broad-spectrum resistance to the fungal powdery mildew pathogen”的研究论文。作者们克隆了大麦白粉病广谱抗性基因Mlo介导抗病反应所必需的Ror1，并对其蛋白结构进行了分析。该基因编码XI类肌球蛋白，部分与过氧化物酶体共定位，可能驱动细胞内抗菌或细胞壁组分等的转运过程，进而促进细胞外免疫。
一、研究背景
Mlo（Mildew locus o）基因功能缺失（mlo）可介导大麦对白粉病的广谱和持久抗性，同时该基因在多种单子叶和双子叶植物中功能保守，其突变型也具有白粉病等病菌抗性。Mlo基因编码具有7个跨膜螺旋结构的膜蛋白，C-端和N-端分别位于细胞内外，其中C-端尾部含有钙调蛋白结合域，与钙调蛋白结合介导致病菌侵染。过去的研究通过EMS诱变Ingrid背景下的高抗性mlo-5，在M2代发现了部分感病材料，进一步利用这些材料鉴定到两个不同的位点Ror1和Ror2（required for mlo resistance），Ror1和Ror2是mlo介导抗病反应所必需的。其中Ror2基因被成功克隆，该基因编码SNARE（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein receptor）蛋白，定位于质膜上，通过与SNAP34和VAMP721蛋白形成三元复合物进而参与抗病反应。Ror1基因被定位于大麦1H染色体长臂着丝粒周围，重组率低且该区段与水稻共线性差，因此未能成功克隆。
肌球蛋白（myosin）是真核细胞内的一类ATP依赖型分子马达，对细胞的运动与细胞内物质传输起着重要的作用。在植物中，肌球蛋白可以结合不同类型的物质，促进细胞内的转运过程。植物中的肌球蛋白只有两类，即VIII类和XI类，它们在结构域、分子量和动力学特性等方面有所不同。目前，VIII类蛋白的功能尚不明确，XI类蛋白被报道参与细胞器沿肌动蛋白微丝的运动过程。
二、研究结果
2.1 Ror1基因的定位与克隆
大麦Ror1基因最早由Collins等（2001）定位在1H染色体0.2-0.5 cM的遗传区间内，后来Acevedo-Garcia等（2013）进一步筛选大麦YAC文库，利用染色体步移的方法，将Ror1定位到大麦1H染色体长臂近着丝粒0.18 cM遗传区间，侧翼标记为AK375542（Pol）和AK355699（Con）。在当时，基因组组装主要利用细菌人工染色体（BAC）簇，BAC簇的排序方式有多种。与遗传作图相比，利用Hi-C可对着丝粒附近区域的BAC簇进行排序，Hi-C图谱将按连续顺序（bin）将每个BAC簇分配到染色体上。
在本研究中，作者利用BLAST确定前期定位的Ror1侧翼基因在基于Hi-C组装的大麦基因组上的位置，大多数基因位于bins 205–211之间，相当于约12 Mb的区间内。通过观察这些基因的顺序，发现与水稻相比，在Ror1基因侧翼的一组共分离标记在大麦中发生了倒位，导致离Ror1基因最近的侧翼标记由AK375542（Pol）变成AK250464（图1），该基因定位在AK250464（HORVU.MOREX.r3.1HG0046150）和AK371545（HORVU.MOREX.r3.1HG0046850, Con）之间，相当于Hi-C bins 208和209，作者们推断Ror1基因位于这两个簇上或它们之间。这两个相邻的BAC库之间的距离小于180 kb，HORVU.MOREX.r3.1HG0046150与HORVU.MOREX.r3.1HG0046850之间共有50个注释基因，包括26个高置信度基因。
图1 Ror1侧翼基因在大麦中的倒位
接下来，作者通过对6个化学诱变的mlo-5ror1双突变体与亲本BC Ingridmlo-5（mloRor基因型）进行RNA-Seq比较分析来确定Ror1。将获得的所有基因型的RNA-Seq读长与目标区间内的BAC进行比对，发现多个mlo-5 ror1双突变体的MLOC_19838和MLOC_52235基因发生突变，两个基因注释都为肌球蛋白XI类基因。对序列进行进一步分析发现它们属于同一个肌球蛋白XI类基因。作者将完整的候选基因进行组装，结合RNA-Seq读长，发现该复杂的基因由39个外显子组成（图2A），编码1,509个氨基酸，在最新的Morex基因组上注释为HORVU.MOREX.r3.1HG0046420，Ingrid品种的该基因与Morex的编码序列一致，mlo-5 ror1-1和mlo-5 ror1-2突变体的基因编码区发生氨基酸的替换，mlo-5 ror1-3、mlo-5 ror1-5、mlo-5 ror1-6和mlo-5 ror1-7的基因发生错义剪切，导致该基因提前终止。为了明确在目标区间内是否存在其他基因的变异，作者通过将RNA-Seq读长与最新的Morex V3基因组比对，只发现mlo-5 ror1-2突变体在HORVU.MOREX.r3.1HG0046420的诱导突变，没有发现其它的突变基因，说明HORVU.MOREX.r3.1HG0046420是Ror1候选基因。
2.2 Ror1蛋白结构和进化树分析
与其它的XI类肌球蛋白相似，Ror1的结构如图2B所示。利用大麦、水稻和拟南芥中的肌球蛋白进行进化树分析，表明Ror1与拟南芥AtMyo11A1和AtMyo11A2，水稻Os02g0545000直系同源（图2C）。蛋白印迹分析表明，7个突变体中仅有一个突变体ror1-1的Ror1蛋白积累量与野生型相似（图3），其突变位点造成错义突变（G715E）。参考鸡的肌球蛋白Myo5A三维结构，该突变位点位于肌球蛋白关键结构relay和converter的中间（图4），relay是肌球蛋白产生动力的元件，与核酸结合域和converter结构域相连。relay和converter中间区域可以影响肌球蛋白动力特性，包括ATP结合和水解，因此G715E可能对Ror1产生严重影响。此外，ror1-2也发生了错义突变（G156E）。
图2 Ror1结构和进化树分析
图3 Ror1蛋白免疫印迹分析
图4 蛋白三维结构分析
2.3 Ror1蛋白水平和亚细胞定位分析
在白粉菌侵染24-72 h后，Ror1条带最明显，之后变弱，其~110 kDa的剪切产物也具有相同的规律（图5）。之后，作者们通过施用可以阻碍ATP结合的肌球蛋白抑制剂NEM（N-ethylmaleimide），发现ror1-4中白粉菌侵染性没有显著提高（图6），推测Ror1可能是大麦中介导mlo抗病性的唯一肌球蛋白。亚细胞定位表明，大麦叶表皮细胞中YFP标记的Ror1分布于细胞核和细胞质（图7），部分与可移动的亚细胞区室共定位，如过氧化物酶体。因此，Ror1可能驱动细胞内物质和细胞器的转运过程，进而介导细胞外的免疫。
图5 白粉菌侵染后Ror1蛋白水平分析
图6 药理学分析
图7 Ror1亚细胞定位
2.4 过表达Ror1的C-端造成显性抑制效应
过去的研究表明肌球蛋白C-末端的过表达会抑制肌球蛋白的功能。作者们通过瞬时过表达Ror1的C-末端蛋白（879-1509），发现产生了与ror1突变体相似的表型，表明Ror1也具有显性抑制效应（图8）。
图8 过表达Ror1的C-末端蛋白分析
三、研究结论
本研究成功克隆了Ror1基因，该基因编码XI类肌球蛋白，位于relay和converter界面的单个氨基酸突变可造成Ror1功能缺失。接种白粉菌之后Ror1蛋白水平显著提高；Ror1部分与过氧化物酶体共定位，过表达C-末端蛋白造成显性抑制效应。Ror1可能驱动细胞内物质和细胞器的转运过程，进而介导细胞外免疫。
原文链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.15930
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